gene cloning과 protein expression

소개글

pGEX-2T벡터를 이용한 PTP 1B 유전자의 클로닝과 발현을 시킨 실험보고서

목차

Ⅰ. Introduction
(1) Transformation
(2) Induction
(3) Protein purification
(4) PTP 1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B)
(5) 단백질 정량
(6) PTP의 kinetic assay
Results
Discussion

본문내용

Ⅰ. Introduction
이번 실험에서 human PTP 1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B) gene을 pGEX-2T vector를 이용하여 E.coli에 transformation 시킨 후, E.coli에서 GST fusion protein을 induction 시켰다. GST-Tag system을 이용하여 단백질의 정제와 분리의 과정을 거쳐서 GST와 PTP 1B의 fusion protein을 얻는다. 이렇게 얻은 PTP 1B를 이용하여 enzyme activity를 측정하였다. 이러한 일련의 과정을 통하여 gene cloning의 과정을 배우고 protein의 분리, 정제 및 활성 측정과정을 배우는 것이 이번 실험의 목적이었다.
(1) Transformation
pGEX-2T vector를 restriction enzyme인 EcoRⅠ, BamHⅠ을 이용하여 잘라주고, T4 ligase를 이용하여 ligation시켜준다. 이렇게 PTP 1B gene이 insertion된 vector를 E.coli에 transformation시켜준다. 이때 이용하는 E.coli는 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell으로 `Competent cell`이라고 한다.
Transformation의 성공 유무는 Ampicillin이 첨가된 고체 배지에서의 생존 여부에 따라 selection된다. 일반적인 E.coli의 경우에는 Ampicillin이 첨가된 배지에서는 생존이 불가능 하지만 pGEX-2T vector가 transformation된 E.coli의 경우에는 vector의 expression에 의해서 Ampicillin에 저항성을 가지게 되기 때문에 생존하게 되고, selection된다. DNA 전기영동 후 size 비교를 통하여 plasmid의 transformation의 여부를 확인하여 insert DNA가 들어간 vector가 transformation이 되었는지의 여부도 확인할 수 있다.

참고 자료

없음