study_of_properties_of_b-galactosidase

소개글

ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside)가 β-galactosidase를 이용하여 ONP(O-nitrophenyl)와 galactose 로 분해되는 과정을 통하여 효소의 반응속도와, 그와 연관된 Vmax(효소 촉매 반응의 최대속도), Km(Michaelis constant) 값을 이해하고, competitive inhibition을 넣어 효소 반응에 어떤 영향을 미치는지에 관해서 알아보기 위해 수행되었다.

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목차

Introduction
Materials
Methods
Data & Result
1. lactose를 넣지 않았을 때
2. 농도의 측정
Discussion
References

본문내용

이번 실험은 ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside)가 β-galactosidase를 이용하여 ONP(O-nitrophenyl)와 galactose 로 분해되는 과정을 통하여 효소의 반응속도와, 그와 연관된 Vmax(효소 촉매 반응의 최대속도), Km(Michaelis constant) 값을 이해하고, competitive inhibition을 넣어 효소 반응에 어떤 영향을 미치는지에 관해서 알아보기 위해 수행되었다.
실험에서 기질은 ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside), 효소는 β-galactosidase, 저해제로는 lactose를 이용하였다. 실험은 ONPG의 농도를 다르게 한 5개의 시험관에 효소를 넣고 1분 간격으로 생성물의 농도(흡광도를 이용)를 측정하는 방식으로 진행하였다. 이 실험에서 β-galactosidase가 ONPG(O-nitrophenyl-β-galactoside)를 galactose와 ONP(O-nitrophenyl)로 분해하는데 이때 ONP는 pH7.7 알칼리 조건에서 이온화하며, 420nm에서 빛을 흡수하여 노란색의 발색작용을 한다. 이를 통해 ONP anion의 O.D. 값을 통해 시간당 생성물의 농도를 구해 효소반응 초기속도를 구한다. 이것을 Lineweaver-burk plot에 대입하여 Vmax 와 Km값을 알 수 있었다. 실제로 Michaelis - Menten equation을 사용하여 graph를 그린다고해도 Vmax값은 근사값으로밖에 구할 수 없기 때문에 기질농도 [S]와 반응속도 Vo에 역수를 취하여 Lineweaver - Burk plot을 이용하여 Km값과 Vmax값을 구하였다. lactose를 넣지 않았을때의 Km값은 0.000042M 이었고, Vmax는 0.0000890M/min 이었다. 저해제를 넣은 실험도 방식은 동일하였고, lactose를 넣었을 때의 Km값은 0.0000890M 이고, Vmax값은 0.0000063M/min 이었다.
실험결과 competitive inhibition(lactose) 를 넣은 때는 그렇지 않은 때와 Vmax 값은 비슷했고 Km 값은 많은 증가를 보였다. 이러한 결과가 나오게 된 이유는, 초기에 lactose와 활성자리를 두고 경쟁하여 초기속도는 줄어들지만, 억제제는 효소(β-galactosidase)에 가역적으로 Binding 된다. Competition substrate(ONPG)를 많이 첨가하게 되면 E-S반응으로 편향시킬 수 있다. 즉, ONPG의 농도가 lactose의 농도보다 현저히 크면 lactose가 β-galactosidasedp 붙을 확률이 크게 줄어드는 것이다.

Introduction
β-galactosidase를 이용한 enzyme kinetics 실험을 통해 Vmax와 Km의 개념을 이해하고inhibition중 하나인 competitive inhibition에서의 Vmax 및 Km의 변화에 대하여 알아본다.

참고 자료

Stryer, 생화학, 일신사, 1976, pp119~123
http://tong.nate.com/freesky2/22771534
http://cti.itc.virginia.edu/~cmg/Demo/kinetics/mm/mmCi/mmCi.html
Lehninger, Principle of Biochemistry, Worth Publishers.Inc, 1993, pp211~219