[생명공학실험]Plasmid DNA 분리

소개글

생명공학실험 Plasmid DNA 분리 실험레포트입니다.
Discussion 부분 신경써서 썻으니 많은 도움 되시기 바랍니다.

목차

1.실험날짜
2.실험목적
3.실험원리
4.실험기구및 시약
5.실험방법
6.Discussion

본문내용

실험원리:

Plasmid DNA란 염색체 밖에 존재하는 DNA(extrachromosomal small circular DNA)이다. Plasmid DNA는 그 자체 내에 replication origin을 가지고 있어서 박테리아 내에서 염색체 DNA 복제와 상관없이 독자적으로 복제되는 특징이 있다. 박테리아의 항생제에 대한 내성이 한 세포에서 다른 세포로 옮겨질 때 plasmid를 통해 이루어진다고 알려진 후 항생제 내성에 대한 유전자 뿐 아니라 항생제 합성이나 독 물질 합성, 질소고정 및 분해, 여러 효소들에 대한 유전자를 함께 가지고 있음이 밝혀졌다.
Plasmid는 한 세포에서 다른 세포로 옮겨갈 수 있는 성질을 지니고 있으므로 유전자를 옮기는 운반자 혹은 vector로 작용을 한다.
즉 외부에서 연구하고자 하는 DNA 조각을 plasmid에 삽입하여 연결시킨 후 박테리아에 넣어 주면 이 형질전환 된 세포내에서 DNA는 독자적으로 복제되므로 DNA 조각을 cloning하는 vector로 이용될 수 있는 것이다.
분자생물학 실험에 사용되는 plasmid는 자연계에 존재하는 plasmid의 특정 부위를 조합하여 만든 plasmid가 이용된다. 이러한 plasmid는 작고 활성이 높은 relaxed replication origin을 가지고 있으며 적어도 항생제 내성에 대한 한 개의 유전자를 지니고 있다. 또한 이들 plasmid 내에는 한 가지 제한효소에 의해 단지 한군데만 절단될 수 있는 부위를 여러개 가지고 있으므로 실험실 내에서의 조작을 쉽게 해주고 있다.
기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다.
이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear 형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있다.

실험기구 및 시약:

E.coli 배양액, 70% EtOH, Alkaline protease, Microcentrifuge
solution Ⅰ 50mM glucose
20mM Tris-Cl(pH 8.0)
10mM EDTA(pH 8.0)
EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 준다. 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것이다.

참고 자료

없음