[생명공학실험2] PCR

목차

1. 실험 목적

2. 실험 원리
1) PCR(polymerase chain reaction)

2) PCR의 수행

(1) Standard PCR reaction mix (ex. 20 ul reaction)
(2) Pipetting & DNA template
(3) Setting up the Laboratory
(4) PCR cycling program
(5) Equipment (Thermocyclers & PCR tubes)
(6) PCR reaction components

3) PCR 반응

(1) Pre-PCR status
(2) Denaturation
(3) Annealing
(4) Extension

4) 일반적인 PCR 반응액 조성 (보통 total vol : 50ul)

5) PCR의 장점과 단점

6) PCR의 응용

(1) RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)
(2) SSCP(Single Strand Conformation Polymophism)
(3) RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)
(4) ISPCR(In Situ Polymerase Chain Reaction)
(5) DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR)

3. 참고문헌 및 사이트

본문내용

Polymerase chain reaction의 약자로 우리말로는 중합효소연쇄반응이라고 풀이할 수 있다. PCR은 특 정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로 서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효 소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부 위의 DNA를 105～108배까지 수시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 여러가지 실험 에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.
원래 PCR에 사용되었던 polymerase는 E.coli의 DNA polymerase I 인 Klneow fragment 였는데 이 는 DNA를 single strand로 풀기 위해 온도를 올리면 파괴가 되어버리기 때문에 매 cycle마다 enzyme 을 다시 넣어 줘야 했었다. Saiki등은 Thermus aquaticus라는 온천에 사는 미생물에서 추출한 polymerase를 DNA polymerase I 대신에 사용하였다. 이 미생물은 섭씨 72도의 고온에서 생존하므로 그 polymerase역시 72도 이상의 고온에서 파괴되지 않고 활성을 잃지 않을 것이라는 예리한 자연현상의 관찰에서 나온 발견이었다.
Gradient PCR은 정확한 온도조절을 할 수 있는 기기로써 Taqpolymerase를 이용하여 소량의 특 정 DNA를 대량 증폭하는데 이용된다. 또한 cell로부터 분리된 mRNA를 이용하여 CDNA의 합성에도 이용 가능하다. 이 기기의 특징은 특정 DNA의 대량 증폭을 위해 25~30 cycle을 반복해야 하는데 이 때 정확한 온도와 시간조절이 필요하다.

참고 자료

• 분자생물학, 한국분자생물학회, 아카데미서적, 1997
• 최신미생물학실험, 홍순우외 12명, 아카데미서적, 1987
• Snyder and Champness, "Molecular genetics of Bacteria" 1997
• DNA Microarray와 최신 PCR 기법 수윤사 (2000)
• http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/
• http://www.bmskorea.co.kr