8주차 재조합 단백질 발현과 분리정제

목차

1. 실험 제목
2. 실험 목적
3. 실험 준비
4. 실험방법
5. 결과 및 토의
6. 참고문헌

본문내용

실험 제목 : 재조합 단백질의 발현과 분리정제

실험 목적 : 단백질 Expression vector 인 pQE30(QIAGEN)에 cloning된 단백질을 IPTG를 이용하여 induction 시키고 SDS-PAGE를 통하여 이를 확인한다.

실험 준비 :
∙pQE30 : E.coli 발현벡터 (3.4kb)
∙IPTG ( Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside )
IPTG는 β-galactosidase의 활성의 유도물질이다. 따라서 lacZ 결손세포를 숙주로 하여 pUC계 plasmid vector DNA를 형질 전환 할 때나, M13 phage vector DNA를 형질 도입할 때 배지에 IPTG 와 X-gal(TaKaRa Code No. 9031)을 첨가하여 놓으면 β-galactosidase 의 α-상보성에 의한 발색의 유무로 간편하게 재조합체를 선택할 수 있다.
또 Lac promoter나 tac promoter를 갖는 발현 vector의 발현 유도제로써 사용한다.
Lac operon의 경우 promoter다음에 operator위치에 평소에는 Repressor가 결합하고 있는 상태다. 이 때 allolactose를 넣어주면 이것은 repressor와 결합하여 Lac operon유전자로부터 떼어내게 되고 이어 단백질 합성이 일어나게 된다. 이 때 쓰이는 allolactose 를 inducer라 하고 이와 비슷한 구조를 가지고 같은 기능을 보이는 화합물중 대표적인 것이 바로 IPTG이다. 다시 말해 IPTG는 Lac operon에서 betagalactosidase 가 만들어질 때 inducer로 사용되는 물질이다.

<중 략>

실험방법
1. E.coli cell을 LB배지 (ampicillin 100㎎/㎖)에서 12시간 동안 종균 배양한다.
2. 이것을 50㎖ LB-ampicillin 배지에 5% 접종한다.
3. cell의 O.D(A260)값이 0.4~0.5정도 되었을 떄 1㎖ sample을 취한다.
4. sample을 원심분리하여 상등액을 제거한 후 1X SDS smaple buffer 50㎕를 첨가 한 후 재현탁 시키고-20℃ 냉동고에 보관한다.

참고 자료

http://blog.naver.com/ozooena?Redirect=Log&logNo=80000929380
http://kin.naver.com/db/detail.php?d1id=11&dir_id=110205&eid=KBtJh3F5Aq0Npv9kPolYLUAQmm3Y/wlc
http://blog.naver.com/toqurdksro7/130002790248
http://chemistry.sogang.ac.kr/lecture/board.cgi?db=031-103&j=v&no=19.1&pg=2