[생화학] 생화학실험

등록일 2003.04.25 한글 (hwp) | 70페이지 | 가격 500원

목차

배양된 미생물에서 ribosomal RNA의 추출
서론
일반고찰
표준용액
실험절차

방사성 probe의 제조
서론
방사성라벨 (radioactive labels)과 뉴클레오티드
Probe의 종류
실험절차
1. Random primer labelling
2. Nick translation
3. Bacteriophage RNA polymerase에 의한 표식
4. 3'-end labelling
5. 5'-end labelling
A. Forward reaction
B. Exchange reaction
6. PCR에 의한 표식
Determination of incorporation
결합되지 않은 라벨의 제거

화학발광 (chemiluminescence)에 의한 핵산의 검출
서론
화학발광반응
실험절차
Probe의 HRP 표식
플루오레세인 hapten에 의한 probe 표식
화학발광표식·검출시스템의 활용

Colony hybridization에 의한 미생물의 DNA 염기서열의 검출서론
실험방법
실험절차

토양미생물 DNA의 polymerase chain reaction (PCR) 분석
실험방법
PCR 장비의 설치순서 및 주의사항

역전사와 PCR에 의한 토양의 mRNA와 rRNA 검출
서론
실험절차

본문내용

DNase는 쉽게 비활성화 되기 때문에 DNA를 분리할 때에는 특별한 주의가 요구되지 않지만 (1.6.1 장 참조), RNase는 도처에 존재하고 있고 쉽게 비활성화 되지 않는다. rRNA를 분리할 때에는 내부의 뉴클라아제 (nuclease)의 작용을 가능한 한 억제해야 하고, 외부에서 뉴클라아제가 유입되지 않도록 막아야 한다. 다음의 몇 가지 지침을 활용하면 분해되지 않은 rRNA를 효과적으로 분리할 수 있다. 자세한 실험 절차는 Johnson에 의해 발표되었다 [4, 5].
뉴클레아제를 제거하기 위해서, 모든 유리 기구를 사용하기 전에 적어도 150 ℃에서 몇 시간동안 oven에서 굽거나, 멸균 또는 알코올로 세척해야 한다. 일회용 플라스틱 용기를 사용하거나 또는 용기를 세제와 함께 멸균한다. 유리나 플라스틱 용기로부터 RNase를 제거하는데 사용할 수 있는 세제가 상업적으로 공급되고 있다. 뉴클레아제가 오염되는 것을 예방하는 가장 간단한 방법 중의 하나는 RNA를 분리하는 동안에 플라스틱 장갑을 착용하고 튜브, 비이커, 플라스크 등의 안쪽을 손으로 만지지 않는 것이다.
용액은 새로운 이차 증류수로 만들어야 하고, 전체의 분리 과정은 가능하면 얼음 위에서 또는 4 ℃에서 수행되어야 한다. 증류수는 diethylpyrocarbonate (DEPC)를 0.2% 수준으로 넣어 주어 처리할 수도 있다. 2 시간 정도 흔들어 주어 DEPC 방울을 확산시키고 멸균한 다음, 아래에 나열된 용액과 완충용액을 만드는데 사용한다.
RNA는 건조시킨 후 4 ℃에 보관하거나, 증류수에 2.0 mg/ml 의 농도로 녹인 후 -20 ℃에 보관한다. 장기적으로 보관하기 위해서는 RNA를 에탄올에 현탁시켜 -70 ℃에 보관한다.

참고 자료

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3. Amann RI, Stromley J, Devereux R, Key R, Stahl DA (1992) Molecular and microscopic identification of sulfate-reducing bacteria in multispecies biofilms. Appl Environ Microbiol 58: 614-623.
4. Amann RI, Zarda B, Stahl DA, Schleifer K-H (1992) Identification of individual procariotic cells by using enzyme-labelled rRNA-targeted oligonucleotide probes. Appl Environ Microbiol 58: 3007-3011.
5. Beck E, Ludwig G, Auerswald EA, Reiss B, Schaller H (1982) Nucleotide sequence and exact localisation of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene 19: 327-336.
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11. Hahn D, Amann RI, Ludwig W, Akkermans ADL, Schleifer K-H (1992) Detection of microorganisms in soil after in situ hybridiztion with rRNA-targeted, fluorescently labelled oligonucleotides. J Gen Microbiol 138: 879-887.
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