[생물학실험] [서울대] 제한효소 반응과 전기영동 (Restriction enzyme & Gel electrophoresis)

소개글

겔 전기영동에 대한 생물학실험 레포트입니다. 논의와 참고문헌 정리가 매우 잘 되어있습니다.

목차

I. 실험 목적

II. 이론적 배경
1.제한 효소 (Restriction Enzyme)
2.전기영동 (Electrophoresis)

III. 실험 재료

IV. 실험 방법

V. 실험 결과

VI. 논의
1. EtBr staining의 원리
2. Agarose gel electrophoresis에서 DNA fragments 이동에 영향을 줄 수 있는 요소
3. Control로 사용한 uncut plasmid DNA에서 두 종류의 bands가 관찰된 이유
4. Restriction Enzyme Mixture에 BSA가 들어가는 이유
5. Star activity란 무엇인가

본문내용

II. 이론적 배경
제한 효소 (Restriction Enzyme)
제한효소는 주로 세균으로부터 분리되는 endonuclease(핵산분해효소)로 DNA를 절단하며, 세균 내에서는 외부 DNA를 제거하는 역할을 한다. 제한효소는 I형, II형, III형의 세 가지 유형으로 분류된다. I형과 III형은 DNA 가수분해에 ATP를 요구하며 메틸화로 DNA의 화학적 변형을 일으킨다. I형은 무작위로 DNA를 절단하는 반면 III형은 특정 서열만을 절단한다. II형은 ATP를 요구하지 않으며 특정 서열만을 절단하기 때문에 실험에서 DNA를 조작하는 데 유용하게 쓰인다. Garrett R.H & Grisham C.M, 곽한식 외 옮김, 생화학 3판, 라이프사이언스, 2006

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1. EtBr staining의 원리
EtBr은 Ethidium bromide의 약어로, 겔 전기영동 실험에서 핵산을 염색하여 시각화할 때 이용되는 물질이다. EtBr은 DNA의 당-인산 골격을 풀어 확장하고, 다른 염기와의 π-π 결합을 통해 안정적으로 intercalation (끼어들어가는) 반응을 일으킨다. 그림 5과 같이 EtBr에서 질소를 포함하는 3고리 화합물인 henanthridine 부분이 평행하게 배열되며, phenyl기는 당-인산 골격 바깥에 수직으로 배열된다.
EtBr은 200nm대의 자외선에서 가장 강한 흡수스펙트럼을 띤다. EtBr을 혼합한 gel에 UV를 비춰주면 EtBr이 이를 흡수하고 590nm의 오렌지색 빛을 방출하면서 DNA의 위치를 관찰할 수 있게 된다.
그러나 EtBr은 10ng 이하의 DNA 성분은 감지할 수 없으며, DNA의 frameshift mutation이 유도하여 강한 돌연변이원, 발암물질, 기형발생인자로 알려져 있다. 그 때문에 EtBr보다 독성이 적은 SYBR®, Gene-Finder®, GoldStar® 등의 대체물질이 꾸준히 개발되고 있다.

참고 자료

Garrett R.H & Grisham C.M, 곽한식 외 옮김, 생화학 3판, 라이프사이언스, 2006
Boyer R.F, Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition, Prentise Hall, 2000
Richards, A.D. & Rodgers, A. (2007) "Synthetic metallomolecules as agents for the control of DNA structure". Chemical Society Reviews, 36 (3), pp.471&#8211;483
Huang Q, & Fu, W.L. (2005) "Comparative analysis of the DNA staining efficiencies of different fluorescent dyes in preparative agarose gel electrophoresis". Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 43 (8): pp. 841&#8211;842
Sambrook J. & Russell D.W. "Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd edition", CSHL Press, 2001,
Brown T.A. Gene Cloning & DNA Analysis: An introduction, 6th edition, Wiley-Blackwell Press, 2010
Williams R. et al, (1996) "BSA and Restriction Enzyme Digestion", Promega Notes Magazine, 59, p.46-48
Robinson, C.R. & Sligar S.G (1993) "Molecular recognition mediated by bound water: A mechanism for star activity of the restriction endonuclease", Journal of Molecular Biology, 234 (2): pp. 302-306