원핵실험 (PCR, Vector, PCR product, T vector, DNA ligation, Transformation, Plasmid, selection, Plasmid DNA 분리, DNA sequencing)

목차

1. PCR
2. Vector
3. PCR product
4. Transformation
5. Plasmid의 구성
6. 항생제를 이용한 selection
7. LacZ를 이용한 color selection
8. Plasmid DNA 분리
9. DNA sequencing

본문내용

Polymerase chain reaction
중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다.

<중 략>

1) Replication origin
이 부분은 plasmid가 자가 복제할 때 처음 인식하는 부위이므로 모든 plasmid에 꼭 필요한 부분이다. 그림에서 보이는 ColE1 ori라고 씌여진 부분이다.
f1(+) origin이라는 것은 plasmid의 origin of replication이 아니라 bacteriophage의 origin이다. 이걸 여기에 삽입해 놓으면 이 plasmid가 때로는 bacteriophage처럼 행동하기도 한다. Bacteriophage의 장점은 life cycle 중에서 single stranded DNA로 존재할 때가 있다는 것인데, 이런 성질이 유용할 때가 있다. 어느 쪽 strand가 single strand 상태로 존재하는가에 따라 f1(+) 혹은 f1(-) origin을 이용한다.

<중 략>

상층액에 3 M sodium acetate, pH 5.2 용액을 1/10 부피로, ethanol을 2.5 부피로 첨가하고 -20°C나 -70°C에서 20분 이상 둔다.
원심분리하여 침전된 순수한 DNA를 TE, pH 8.0 용액에 녹인다. TE, pH 8.0 용액은 Tris-Cl, pH 8.0 용액이 10 mM, EDTA, pH 8.0 용액이 1 또는 0.1 mM로 되어 있는 용액이다. DNA 는 이름 그대로 산(acid)이기 때문에 수용액에 있으면 조금씩 pH가 낮아져 DNA가 손상된다고 하므로, 위와 같이 tris buffer를 넣어준다.

참고 자료

없음