His-tag affinity chromatography, 친화 크로마토그래피

소개글

히스텍 친화성 크로마토그래피 결과레포트입니다.

목차

실험방법

실험결과

결과분석

참고문헌

본문내용

두번째 이유는 promoter에 있다. 이 vector는 T7 promoter를 가지는데 이것은 아주 강력한 프로모터이다. 만약 이 gene을 vector에 넣어 E.coli에 넣어 키우면 아마 우리가 넣은 유전자의 단백질 뿐 아니라 다른 단백질 또한 만들어질 것이다. 여기에 강력한 프로모터를 같이 넣어주면 다른 단백질보다 더 우월하게 생성될 것이고 단백질 생산도 많이 되어 정제하기에 편리할 것이다.
세번째 이유는 이 벡터를 이용하면 His-tag를 단백질의 N-terminal 끝에 붙여주기 때문이다. 정확히는 잘 모르겠지만 His-Tag가 적절한 위치에 있지 않으면 정제하는데 어려움이 있거나 frame shift가 일어날 수 있기 때문이다.

우리는 실험에서 3가지의 fraction을 얻었다. 각각 Waste, Elute, Washed fraction이다.
Waste fraction은 10% elution buffer 10ml를 넣어 얻었는데, elution buffer 농도를 옅게 처리하여 완전히 binding하지 못한 단백질을 떨어뜨렸다. 우리가 정제하고자 하는 단백질이 아닌 단백질에도 his가 있기 때문에 약하게 bead와 결합한다. 따라서 묽은 농도의 elution buffer를 이용하여 waste fraction을 얻었다.
Elute fraction은 35% elution buffer를 4ml 넣어주었다. 이 fraction에서 우리가 원하는 target 단백질이 정제되어 나온다. 왜 어떻게 우리가 원하는 단백질이 35%의 elution buffer에서 용출되는지 확실히는 알지 못하나 내가 생각하기에는 여러가지 문헌과 이미 축적되어 있는 date base를 이용해서 농도를 알고 있는 것 같다. 조교님은 미리 어느 농도에서 잘 용출되는지 실험을 해보시고 우리에게 알려주신 것 같다. 여러 논문과 data base로 용출 농도를 안 뒤 그 elution buffer를 넣어준다. 그러면 단백질의 his-tag 부위와 nickel이온이 결합해 있었는데 그것보다 더 결합력이 좋은 Imidazole이 nickel이온과 결합하여 단백질을 용출시키게 된다.

참고 자료

http://ask.nate.com/qna/view.html?n=3545765
http://ampliconexpress.com/vector_maps/pET28_map.pdf
http://kaykong.blog.me/130025402893
http://en.wikipedia.org/wiki/SDS_PAGE
http://blog.naver.com/allafolly?Redirect=Log&logNo=50035238