westernblot 전반적인 과정 기술

소개글

westernblot에 관련된 세부적인 내용과 주의해야할 사항을 기술하였고,

처음 실험을 할시에 필요한 기본적인 용액의 조성을 상세히 설명해 놓았음

목차

Westernblot 의 전반적인 과정
1. Sample preparation
2. Mini-protean Ⅱcell assembling (Bio-Rad)
3. Seperating gel
4. Stacking gel
5. electrophoresis
6.Transfer
7.Membrane processing
8. Detection
Reagent for Western Blot

1. 4×Tris․Cl/SDS, pH 6.8
2. 4×Tris․Cl/SDS, pH 8.8
3. 30% acrylamide/0.8% bisacrylamide
4. 10% APS (Ammonium persulfate)
5. 4×electorhoresis buffer
6. Transfer buffer
7. Ponceau
8. Laemmli buffer
9. 10×TBS (Tris Buffer Saline)
10. 5×Sample Buffer

본문내용

특정단백질을 Detection 혹은 quatititation하기 위해 수행하는 분석방법으로써, 단백질과 단백질간의 specific한 interaction을 이용한다.
주로, horseradish peroxidase (HRP)나 alkaline phosphatase 등과 같은 효소를 antibody에 결합시켜 형광으로 인하여 그 양을 detection할 수 있다.

1. Sample preparation

2. Mini-protean Ⅱcell assembling (Bio-Rad)

- D.W로 한번 닦고 alcohol로 한 번 닦는다. 잘 안 닦으면 gel이 안 떨어진다.
Gel cast를 casting 후 comb를 미리 꽂아 약 1cm 밑에 선을 표시 한다.
- gel 굳으면 부피가 줄어든다.
- 증류수를 넣어서 새는지 확인한다.




3. 30% acrylamide/0.8% bisacrylamide
- Mix 30g acrylamide and 0.8g N,N`-methylene-bisacrylamide in a total volume of 100ml dH2O. Filer the solution through a 0.45um filter and store at 4℃ in the dark, Discard after 30days, since acrylamide gradually hydrolyzes to acrylic acid and ammonia.
4. 10% APS (Ammonium persulfate)
- 0.1g APS/1ml dH2O
- -20℃ store
- 25% stock을 만들어 -20℃에 보관하고 10%는 4℃에 보관하여 쓰기도 함
5. 4×electorhoresis buffer
- Tris-base(12.1g) + Glycine(57.6g) + SDS(0.1%)
- complete to 1000ml
6. Transfer buffer

참고 자료

없음