transformation

소개글

전체적인 cloning 과정을 살펴보면 먼저 insert를 PCR시킨 뒤에 NdeⅠ, XhoⅠ으로 자르고, 또한 vector인 pET23을 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 자른다. 그 뒤 이 둘을 ligation 시키고 E.coli competent cell의 plasmid를 이용해 transformation 과정을 거친 뒤에 제대로 들어갔는지 확인하면 된다.

목차

1. Introduction
2. PROCEDURE & RESULTS
< R E F E R E N C E >

본문내용

1. Introduction


전체적인 cloning 과정을 살펴보면 먼저 insert를 PCR시킨 뒤에 NdeⅠ, XhoⅠ으로 자르고, 또한 vector인 pET23을 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 자른다. 그 뒤 이 둘을 ligation 시키고 E.coli competent cell의 plasmid를 이용해 transformation 과정을 거친 뒤에 제대로 들어갔는지 확인하면 된다.

2. PROCEDURE & RESULTS

<primer stock의 dilution>
먼저 210bp를 PCR할 때 쓸 primer F와 R을 100μM stock으로 만든 다음에 새 tube에 1/5로 dilution 한다. (DDW 80㎕에 primer stock 20㎕를 넣는다.)

<Insert의 PCR>
그 다음 PCR tube에 다음과 같이 넣고 PCR을 돌린다.

annealing할 때 시간은 1Kb당 1분으로 계산하고 온도는 G≡C 4℃, A=T 2℃으로 계산하면 된다. 따라서 primer의 서열이 ACGTTAG라면 2 + 4 + 4 + 2 + 2 + 2 + 4 = 20℃가 annealing 의 온도가 된다.

<agarose gel을 통한 size 확인>
PCR이 끝난 뒤에 agarose gel에 100V에서 20분 전기영동 시킨다.
agarose gel을 만드는 방법은 먼저 TBE buffer 2.5X를 0.5X로 dilution 한다. (TBE buffer 20ml + DDW 80ml)
여기서 20ml를 버리고 80ml를 agarose 0.8g을 넣어서(1%) 전자레인지에 3분 정도 돌린다. 여기에 EtBr을 1λ만큼 넣어서 작은 agarose gel과 큰 agarose gel(2 well)에 각각 10ml 60ml 정도 나누어 부어 굳힌다. EtBr은 DNA 사이사이에 끼어들어가 DNA가 어느 위치에 있는지 알 수 있게 해준다.

참고 자료

< R E F E R E N C E >
1) Gene cloning and DNA analysis An Introduction, T.A.Brown, Fourth Edition
2) Size marker
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3) pET 23c vector
http://www.merckbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB051.pdf